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miRNA对于细胞的各项生理活动均发挥着重要作用，在细胞周期调控中，miRNA可以通过靶向和抑制细胞周期调控基因从而实现对细胞增殖的抑制。然而，在多种肿瘤细胞中，miRNA的水平均表现出出明显下降，这往往会导致细胞周期的过度激活，最终使细胞发生异常增殖。因此，miRNA可能是一种有潜力的肿瘤治疗靶点。
近日，来自北京大学的杜鹏团队在Cell杂志发表了一项重要研究[1]，通过在肿瘤细胞中异源表达来自植物的RDR1蛋白，成功提高了肿瘤细胞的全局miRNA水平，并显著修复了3’端存在异常截短的miRNA，最终有效地抑制了肿瘤细胞周期和增殖。
该研究为肿瘤的miRNA靶向疗法提供了一种全新的思路。
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RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种小RNA介导的转录后调控现象。根据来源及作用特点，小RNA主要可分为microRNA（miRNA）和小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）。其中，miRNA主要由内源转录产生的pri-miRNA加工而来，通过形成功能性RNA诱导沉默复合物（functional RNA-induced silencing complexe, RISC），发挥抑制基因表达的作用。
在细胞周期调控中，miRNA可以通过靶向和抑制相应的细胞周期调控基因而实现对细胞增殖的抑制。然而，在多种肿瘤细胞中，均表现出miRNA的作用失调，尤其是其全局表达水平发生了显著下降，这直接导致了对细胞周期抑制作用的解除。
与miRNA不同，siRNA主要由双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）底物加工而成，其同样可以通过形成RISC来抑制基因的表达。在植物中，dsRNA可以由不同类型的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerases, RDRs）合成。然而，由于进化上的丢失，包括人在内的具有次级免疫系统的脊椎动物缺失RDR介导的siRNA产生机制。
基于这些，研究人员们提出了想法：能否通过异源表达植物的RDR蛋白，提高肿瘤细胞中小RNA水平，从而增强对细胞周期的抑制，抑制肿瘤的增殖？
为了证实上述猜想，研究人员首先需要构建能够表达RDR的细胞系。在这里，研究人员分别将来自拟南芥（Arabidopsis thaliana, At）和水稻（Oryza sativa, Os）的RDR1基因克隆到携带共表达EGFR基因的慢病毒载体中，再用这些载体感染不同的哺乳动物细胞，获得了13个能够诱导表达RDR1的细胞系，其中包括7个实体瘤（肺癌A549, H结直肠癌CT116, 肝癌HepG2, 宫颈癌HeLa, 肺癌H1299, 前列腺癌PC-3, 骨肉瘤U-2OS）、3个白血病（急性T细胞白血病Jurkat, 慢性粒细胞白血病K562, 急性淋巴细胞白血病NALM6）和3个非癌体细胞系（小鼠胚胎细胞NIH/3T3，人视网膜色素上皮细胞RPE-1，人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1），还有两个能够稳定表达RDR1的胚胎干细胞系（小鼠V6.5和人WIBR3）。
通过使用能够表达mcherry-OsRDR1融合蛋白的慢病毒载体，研究人员发现，OsRDR1蛋白明显定位于胞质而非细胞核，这意味着RDR1也许能在胞质中合成dsRNA，并被Dicer进一步加工成siRNA。哺乳动物dsRNA在胞质内被Dicer切割成siRNA，如定位于核内，则产生的dsRNA可能无法转运到核内以发挥作用。最终，研究人员发现AtRDR1和OsRDR1都能够显著抑制所有10种癌细胞的增殖，对其他5种非癌细胞系没有影响。
异源表达RDR1能够显著抑制癌细胞的增殖
为了探究RDR1的具体作用机制，研究人员进行了进一步的实验。基于RNA-seq的基因集富集分析（Gene set enrichment analyses, GSEA）表明，AtRDR1和OsRDR1在所有7种癌细胞系中均抑制了细胞周期过程，而在非癌对照细胞中则无这一现象。具体而言，在肿瘤细胞系中有超过30个核心细胞周期基因被RDR1强烈抑制。研究人员也通过Western blot和Edu/PI染色实验进一步验证了这一结果，即异源表达RDR1可显著抑制肿瘤细胞的细胞周期。
异源表达RDR1可显著抑制肿瘤细胞周期
接下来，研究人员对有/无RDR1诱导表达的肿瘤/非肿瘤细胞系进行了小RNA测序，结果显示，在编码基因、转座子、非编码RNA或其它基因组区域并没有检测到任何来自dsRNA的siRNA。这一现象说明，RDR1并非是通过重建siRNA通路来抑制细胞周期。
而在另一方面，研究人员也惊讶地发现，表达RDR1使得肿瘤细胞中整体miRNA水平明显提高，且这一过程并非是由于细胞周期阻滞导致的。考虑到在多种类型的肿瘤细胞中，miRNA的整体水平均表现为下降，研究人员再次提出假设：RDR1可能是通过提高整体miRNA的表达来抑制细胞周期和细胞增殖的。
为了印证这一猜想，研究人员敲低了DROSHA、DGCR8和AGO2等miRNA通路关键蛋白的表达，结果发现，RDR1对细胞周期和细胞增殖的抑制作用被解除了。另一方面，过表达AGO2却显著增强了RDR1介导的这种抑制作用。
之后，研究人员还通过交联免疫共沉淀测序（crosslinking immunoprecipitation sequencing, CLIP-seq）分析发现，诱导表达RDR1显著增强了RISC与靶细胞周期基因的结合和识别。这些结果表明，RDR1对细胞周期的抑制作用确实是通过对miRNA的调控实现的。
RDR1通过提高整体miRNA水平实现对肿瘤细胞周期的抑制
接下来，研究人员想要了解RDR1介导的miRNA通路增强的具体机制。通过对来源于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的32种人类患者肿瘤样本、4种非TCGA原发肿瘤样本、39个正常组织样本以及26个癌症细胞系的大规模基因组数据挖掘，研究人员发现，在许多主要的肿瘤样本或癌细胞系中，大部分miRNA表现为3’末端只有一个碱基突出，而正常miRNA3’末端应该有2个碱基突出。
因此，研究人员猜测，这样的3’末端异常截短的miRNA可能并不能被AGO2蛋白正常识别。随后的体内或体外实验也确实证明了这一点，即AGO2对正常的3’末端有两个碱基突出的miRNA的亲和力明显高于异常截短的miRNA。
肿瘤细胞中有大量3’末端截短的miRNA
之后，研究人员进一步证实，RDR1会优先识别3’端发生截短的miRNA，并为其添加单核苷酸（A、T、C或G）。而小RNA northern blot分析结果也显示诱导表达RDR1后，肿瘤细胞中3’末端异常截短的miRNA含量显著减少而长度正常的miRNA则显著增加。
异源表达RDR1可修复3’末端截短的异常miRNA
最后，为了探究RDR1异源表达的实际应用前景，研究人员进行了多方面的综合验证。小鼠异种移植实验表明，RDR1可显著抑制实体瘤（肺癌A549和H1299、前列腺癌PC-3）（如下图A-C所示）和淋巴癌（Jurkat、K562、NALM6）的发展。而使用纳米颗粒和AAV传递系统则分别能有效实现RDR1蛋白的体外和体内传递。这些结果都说明，基于RDR1的miRNA靶向疗法或许是一种有潜力的肿瘤治疗手段。
基于RDR1的miRNA靶向疗法可能是一种有潜力的肿瘤治疗手段
近些年来，已经有越来越多的miRNA被鉴定为肿瘤促进/抑制因子，作为一种有效的分子靶点，目前针对miRNA的肿瘤治疗方案主要有两种，一种是通过miRNA类似物补偿肿瘤抑制miRNA的作用，或者通过人工合成反义寡核苷酸，阻断肿瘤促进miRNA的作用。然而，在临床实验中，这些方法都表现出强烈的毒理学效应，这为其进一步发展及应用提出了挑战[2]。
与以上思路不同，此研究另辟蹊径，通过异源表达植物RDR1基因，实现了对肿瘤中低miRNA水平的补偿及异常miRNA的修复，最终使肿瘤细胞的细胞周期受到抑制。总的来说，研究为靶向miRNA的肿瘤治疗提供了一种新思路，未来期待这一疗法的进一步发展能为广大癌症患者带来更多的惊喜。
参考文献：
[1] Qi Y, Ding L, Zhang S, et al. A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency. Cell. 2022;185(11):1888-1904.e24. doi:10.1016/j.cell.2022.04.030
[2] Suski JM, Braun M, Strmiska V, Sicinski P. Targeting cell-cycle machinery in cancer. Cancer Cell. 2021;39(6):759-778. doi:10.1016/j.ccell.2021.03.010
责任编辑丨王雪宁
