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胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性极强的癌症。
过往研究表明，表皮生长因子受体（EGFR）扩增是GBM中一个重要的致癌驱动因素[1-2]。然而，多项靶向EGFR的临床试验均未能取得良好疗效，表明EGFR扩增在GBM中的功能作用或有不同[3-4]。
据统计，约57.4%的原发性GBM伴随野生型EGFR（EGFRwt）基因的扩增，并且这与共同扩增的GBM特异性突变EGFRvIII（2-7号外显子缺失）相关[5-6]。有研究表明，EGFRvIII能协同触发配体诱导的或构成型激活的EGFR信号传导（在没有EGFR配体的情况下，由GBM中EGFR的表达导致自发二聚体化导致的信号传导[7]）。
还有研究发现，构成型和配体诱导的EGFR激活触发了不同的信号通路[8-9]。目前，EGFR配体对于GBM发生发展的生物学功能，以及在GBM治疗中的临床实践意义是不清楚的。因此，构成型和配体诱导的EGFR激活在GBM中的作用和功能值得探索。
近日，来自德克萨斯大学西南医学中心的Amyn A. Habib教授团队，在《自然·细胞生物学》期刊上发表研究成果[10]。
他们发现，构成型激活EGFR通过激活TAB1-TAK1-NF-κB-EMP1通路促进GBM细胞侵袭。然而，配体诱导的EGFR激活通过上调桥接整合子3（BIN3），进而抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路，导致GBM细胞增殖和侵袭能力下降。
简单来说，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR并抑制肿瘤细胞侵袭，将EGFR的作用从致癌基因转变为抑癌基因！郭高博士为论文的第一作者。
论文首页截图
让我们一起看看这项研究具体是如何开展的。
为了探索配体诱导的和构成型激活的EGFR及其介导的信号通路在GBM中的生物学作用。研究者在妙佑医疗国际患者来源的异种移植细胞系（PDX）和原代GBM神经球培养细胞中，检测了表皮生长因子（EGF）对GBM细胞侵袭的影响。
结果表明，添加EGF（EGFR配体）抑制了表达EGFRwt或EGFRvIII+EGFRwt的多个GBM细胞系的侵袭。使用siRNA敲降EGFR后，抵消了EGF对侵袭的抑制作用，表明GBM的侵袭作用是通过EGFR特异性介导的。
b：添加EGF，抑制GBM细胞侵袭；c：敲降EGFR后，抵消了EGF对侵袭的抑制作用
研究者也发现，将EGFR表达水平低的GBM细胞暴露于EGF会促进侵袭。然而，当EGFR在这些细胞系中过表达时，添加EGF又会抑制侵袭。
同时，使用不同剂量的siRNA敲降EGFR，随着EGFR表达水平的降低，EGF从抑制到促进侵袭逐渐过渡，这表明EGFR的表达水平，决定了配体诱导的EGFR信号传导的结果是促进还是抑制侵袭。
同时，研究者将GBM细胞注射到小鼠的大脑中，并通过体内活体显微镜实验证实，EGF抑制了GBM细胞的侵袭，并且EGF在高水平或低水平表达EGFR的多个细胞系中诱导细胞增殖。
然而，当siRNA敲降Src胶原同系物衔接蛋白（Shc）时，EGF诱导的增殖被抑制。Shc敲降抑制了响应EGF的丝裂原活化蛋白激酶1（ERK）激活，表明配体诱导的EGFR激活通过经典的Shc-ERK途径诱导增殖。
小鼠模型中EGF抑制了GBM细胞的侵袭
接下来，研究者进一步探索了EGFR抑制GBM细胞侵袭的下游信号机制。
RNA微阵列分析、WB和qPCR结果表明，BIN3是在添加EGF时上调程度最高的基因。重要的是，siRNA敲降BIN3阻断了EGF抑制GBM细胞侵袭的能力，同时过表达BIN3抑制细胞侵袭。
接下来，研究者利用质谱鉴定了与BIN3相互作用的蛋白，并找到了胞质分裂7（DOCK7）分子。
免疫共沉淀实验表明，EGF诱导了DOCK7和BIN3之间的相互作用，siRNA敲降DOCK7导致细胞侵袭性和RhoGTPase活性降低。
在DOCK7敲降的细胞中，添加EGF并没有进一步抑制侵袭或降低RhoGTPase活性，表明DOCK7位于BIN3的下游。同时，siRNA敲降BIN3抵消了EGF引起的RhoGTPase活性下调。
免疫共沉淀实验，EGF诱导了DOCK7和BIN3之间的相互作用
研究者也发现EGF诱导了GBM细胞中DOCK7-Y1118的酪氨酸磷酸化。DOCK7-Y1118F突变导致突变体不能与BIN3结合。结果表明，DOCK7的酪氨酸磷酸化以及EGFR上调BIN3对于DOCK7-BIN3相互作用同样重要。
随后，在无胸腺小鼠的颅内注射TGFα（EGFR配体）稳定表达的GBM12细胞或GBM9神经球细胞，结果表明，TGFα增加提高了小鼠存活率以及抑制了肿瘤侵袭能力。同时，在表达TGFα的肿瘤中，细胞增殖能力增强，但肿瘤体积明显减小。外源性输注EGF也会导致同样的结果。
b：TGFα增加提高了小鼠存活率；c：TGFα增加抑制了肿瘤侵袭
以上结果表明，配体诱导的EGFR激活通过上调BIN3，进而抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路，导致GBM细胞增殖，侵袭能力下降。
紧接着，研究者探索了构成型EGFR信号通路在GBM细胞中的作用及背后机制。
研究者发现，上皮膜蛋白1（EMP1）是一个通过构成型EGFR信号上调的基因，siRNA敲降EMP1抑制了GBM中EGFR表达引起的细胞侵袭。
质谱分析表明，TAB1与TAK1可能参与了EGFR的构成型信号传导。并且，TAB1能够激活NF-κB[11]。siRNA敲降TAB1导致构成型EGFR介导的侵袭、TAK1的激活和NF-κB亚基p65磷酸化的丢失。siRNA敲降TAB1或TAK1也阻断了EGFR诱导的EMP1的上调，表明TAB1-TAK1-NF-κB-EMP1信号轴驱动了构成型EGFR诱导的细胞侵袭。
此外，研究者发现，在构成型激活的EGFR中观察到低水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有利于激活NF-κB-EMP1途径，促进细胞侵袭。而在配体诱导的EGFR中检测到高水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有助于激活EGR1-BIN3信号通路，抑制侵袭。
接下来，研究者发现Jak1和Jak3抑制剂Tofacitinib，在多个GBM细胞系中高度上调BIN3的水平，以及抑制细胞侵袭。Tofacitinib也能上调肝素结合的EGF水平（HB-EGF：EGFR配体），并诱导EGFR的高度激活。
同时，Tofacitinib阻断了STAT1和STAT3的磷酸化，而STAT3敲降模拟了Tofacitinib的作用，引起HB-EGF分泌增加、EGFR活化以及侵袭抑制。此外，西妥昔单抗能够完全抑制Tofacitinib诱导的EGFR活化、BIN3上调和侵袭抑制。
Tofacitinib在多个GBM细胞系中高度上调BIN3的水平并抑制细胞侵袭
研究者又探索了Tofacitinib对于小鼠颅内GBM肿瘤的影响，肿瘤细胞为GBM12TGFα的小鼠（高水平的EGFR配体），从Tofacitinib治疗中没有额外受益。然而，肿瘤细胞为GBM12V的小鼠（低水平的EGFR配体）在Tofacitinib治疗后，肿瘤侵袭能力下降，小鼠生存率显著增加。
此外，Tofacitinib也增加了小鼠肿瘤的增殖能力。稳定敲降HB-EGF的GBM39细胞对Tofacitinib治疗更敏感。这些结果表明，Tofacitinib可能对EGFR配体水平较低的EGFR扩增的GBM肿瘤更有效。
GBM12V和GBM12TGFα的小鼠在Tofacitinib治疗后生存情况，及肿瘤侵袭能力
在体内和体外实验中均证实了EGFR配体具有激活并逆转EGFR为抑癌基因的能力，为了在数据库中检测EGFR配体的表达情况，研究者进行了进一步的生信分析。
癌症基因组图谱（TCGA）数据显示，7个EGFR配体在GBM中有不同的表达，其中HB-EGF、TGFα和EGF是GBM中最丰富的配体，EGFR配体在非EGFR扩增的GBM中具有非常强的致癌作用（P=0.0009）。然而，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体具有显著的抑癌作用（P=0.0355）。
由于EGFR配体在GBM发生发展中表现出的双重作用，研究者进一步探索了EGFR配体及相关蛋白与GBM患者预后之间的关系。
结果表明，当GBM患者肿瘤内EGFR配体水平较低时，肿瘤细胞内EGFR的激活方式主要为构成型信号传导，而这部分患者的预后也较差。此外，相比于EGFR磷酸化水平较低的患者，EGFR磷酸化水平较高的患者，预后更好（P=0.0254）。并且，在36个GBM样本中，随着BIN3蛋白水平的升高，患者预后逐渐改善。
同时，为了了解EGFR及配体在肿瘤内是否存在区域表达的差异，研究者开展了酶联免疫吸附试验（ELISA）。
结果表明，在36个切除的GBM样本中，EGFR的表达在肿瘤区域之间没有显著差异，然而，HB-EGF在肿瘤中心部分的表达水平却更高，它也是这36个样本中最丰富的EGFR配体。更进一步的是，已有研究发现Sp1能促进HB-EGF的转录，Sp1的过表达上调了HB-EGF的表达水平[12]。同时，Sp1与HB-EGF共同定位于肿瘤组织相同的区域，这表明转录因子可能参与调节了EGFR配体的区域表达。
总的来说，这项研究表明在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR并抑制肿瘤细胞侵袭，将EGFR的作用从致癌基因转变为抑癌基因，而这依赖于配体诱导的EGFR激活，上调BIN3并抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路来实现。
这意味着，基于EGFR和EGFR配体水平的患者分层，可能有助于预测能从靶向EGFR中获益的患者亚群。
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参考文献
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